皮肤改善剂七叶树提取物的成纤维细胞力产生促进机理堀田光行花王

  皮肤改善剂七叶树提取物的成纤维细胞力产生促进机理堀田光行花王生物科学研究所绪言众所周知, 皮肤因外眼角、 L ]角、 额头等反复表情, 导致对皮肤变形, 并且在经常承受紫外线照射的部分容易出现变行。 即通过暴露于紫外线而导致皮肤组织变化, 从而降低了皮肤弹性, 因反复的表情变化而降低了对皮肤变形的抵抗力和复原力, 皮肤变形逐渐对皮肤定形。 我们认为通过抑制这种皮肤变形, 能够改善皮肤, 对不易引起皮肤变形的绷紧的皮肤, 以及皮肤成纤维细胞力的产生关系进行了研讨。像成纤维细胞那样的非肌细胞的收缩力对细胞的形态、 血管形成、 创伤治愈等发挥了极为...

  皮肤改善剂七叶树提取物的成纤维细胞力产生促进机理堀田光行花王生物科学研究所绪言众所周知, 皮肤因外眼角、 L ]角、 额头等反复表情, 导致对皮肤变形, 并且在经常承受紫外线照射的部分容易出现变行。 即通过暴露于紫外线而导致皮肤组织变化, 从而降低了皮肤弹性, 因反复的表情变化而降低了对皮肤变形的抵抗力和复原力, 皮肤变形逐渐对皮肤定形。 我们认为通过抑制这种皮肤变形, 能够改善皮肤, 对不易引起皮肤变形的绷紧的皮肤, 以及皮肤成纤维细胞力的产生关系进行了研讨。像成纤维细胞那样的非肌细胞的收缩力对细胞的形态、 血管形成、 创伤治愈等发挥了极为重要的作用。 通常, 对发挥非肌细胞力方面, 能够产生从特化的平滑肌细胞1/10到1/100的力的作用。 因此, 可以认为, 成纤维细胞在真皮产生的收缩力以某种形式对皮肤的形态、 皮肤的弹性等产生影响。我们使用所谓真皮型成纤维细胞包埋胶原凝胶培养系, 探索了产生细胞的收缩力的基剂。 因此,发现七叶树( A e se u lu sh ip p o c a sta n u m )的提取液具有提高细胞的收缩力的作用。 这种七种树提取液的安全性高, 适于与化妆原料配合。 所以, 通过使用试验, 确认了这种提取液对皱纹的有效性, 并且, 研讨了七叶树提取液对成纤维细胞的收缩力具有促进作用的机理。方法七叶树提取液从丸善制药株式会社( 日本广岛)购买了七叶树( A escu lu sh ip p o c a sta n u m )提取液。 蒸发固态残余物约为1. 0w t/v 0 1%( 残余物重量%)。细胞培养将人的皮肤成纤维细胞按照含有5%牛胎儿血清( F B S )的D u lb e c e o Sm o d if ie dE a g le Sm e d iu m( D M E M )条件下进行了培养。 在本研究中使用了继代数3~8 的细胞。成纤维细胞包埋胶原凝胶的制作在胶原溶液( 细胞基质I型, 新田明胶株式会社( 东京))中将浓缩的培养基、 H E P E S . N a C o , 溶7 液、 F B S 、 精制水以及成纤维细胞的分散液以4 。 C 缓慢地混合, 制作含有3. 0 × 10 5 cells/m l的细胞以及1. 5m g /m l的胶原的细胞分散胶原溶液。 将细胞分散胶原溶液流入硅橡胶制模具( 25m m × 4 5m m 、深5m m )内, 以37 。 C 使其凝胶化。 24 小时后添加无血清培养基, 去除模具, 使其在无血清培养基中浮游。收缩力的测量根据周知的文献的方法, 测量了在胶原凝胶提取液培养的成纤维细胞的收缩力。 这就是将成纤维细胞包埋胶原凝胶与张力测量JI; }j变换器连接, 在无血清培养基中以37 。 C 进行保温, 为达到稳定而进行1小时的适应。 在无血清培养基中添加溶解的各种植物提取液, 使其产生作用, 使用B IO P A Cs y s t e m ( B I O P A CS y ste m sIn c. , S a n taB a r b a r a , C A , 美国)记录收缩力的变化。使用阻断剂的张力发生阻断试验根据K o lo d n e y 等人的论文, 采用成纤维细胞胶原凝胶培养法, 测量了张力。 细胞松弛素D ( 2 u M )。使各种阻断剂产生30 6 0 分钟的作用后进行阻断剂的评价, 接着以0 . 0 0 l%的七叶树提取液使其产生作川, 测量了产生的力。应力纤维的萤光显微镜观察将在胶原盒载片上培养的成纤维细胞在无血清培养基中培养24 小时。 将细胞在七叶树提取液( 0 . 0 0 3残余物%)中进行10 分钟处理后, 用福尔马林( 甲醛水)固定, 使用若丹明鬼笔环肽( R h o d a m in ep h a llo id in )( M o le c u la rP r o b e sln c. , E u g en e, 美国)进行染色, 用萤光显微镜进行了观察。人使用试验方法在人使用试验方面, 对4 0 名健康的女性志愿者( 35. 4 5岁、 平均38 . 4 岁)详细说明试验的目的、方法等, 在征得对方的同意后进行了试验。 试验期间为9 周, 通过双盲法( 系指在药物临床评价时不让病人和医生知道所试药物究属何种)进行了试验。 皱纹程度根据相片比例尺, 通过专门评判小组的日视评分进行了评价。 按照下列从等级0 ~等级4 , 对皱纹的程度进行分类, 并且包括再4 等分的中间等级( 每0 . 25), 对总共17 个等级的皱纹程度进行了评价。等级0 = 无皱纹等级l= 稍微有皱纹等级2= 稍微/略有皱纹等级3= 有皱纹等级4 = 有明显的皱纹在进行日视评分评价之前, 让志愿者在恒温高湿( 。 誊温25℃、 湿度34 . 4 0 %)条件下, 在经控制的房间内至少进行了1 5分钟的适应阶段。涂敷方法( T o p ic a l A p p lic a tio n )制作含有3%的七叶树提取液的美容液, 在眼睛的周围至少1天涂敷2次, 连续进行9 周。 作为对照美容液, 使用了不含有七叶树提取液的安慰剂。 志愿者使用约0 . 2m l的美容液, 涂敷1次。R 统计分析( S ta tistica lA n a ly sis)在人评价试验中使用了M a n n W h itn ey Utest。 此时, 将P < 0 . 0 5作为显著水平。结果和考察通过细胞松弛素D 的力产生阻断以及肌动蛋白应力纤维的形成若使七叶树提取液产生作用, 则成纤维细胞便产生力。 在这种条件下, 通过平均产生13达因的力, 在产生力的状态下, 若使细胞松弛素D ( C y to ch a la sinD )产生作用, 便取消力的产生。 结果表明, 由七叶树提取液所产生的力必须具备肌纤蛋白丝的重合。 因此, 使用若丹宁鬼必环肽( R h o d a m in eP h a llo id in e)进行试染色时, 发现通过七叶树提取液的作用, 具有与凝血酶相同显著的应力纤维的形成作用。像这种诱导成纤维细胞的收缩力的植物提取液在体内的活性并不明显。 但是, 成纤维细胞等非肌细胞的收缩力对细胞的形态、 血管形成、 创伤治愈等方面, 例如, 正如成肌纤维细胞( m y o f ib r o b la sts)中所发现的那样, 发挥了极为熏要的作用。 所以, 通过七叶树提取液所诱导的成纤维细胞的收缩力对皮肤的形态、 弹性变化发挥了重要作用。 因此, 我们借助志愿者对该提取液的皱纹改善效果进行了评价。在人使用试验中, 使用含有3%的七叶树提取液的美容液, 对4 0 名健康的女性志愿者进行了试验。 在眼睛周围至少1天2次涂敷美容液, 连续进行9 周。 试验结束时, 4 0 名全体志愿者均未出现刺激、 红斑。分析皱纹改善效果的结果表明, 与0 周时进行比较, 9 周后, 发现在外眼角涂敷安慰剂群的皱纹评分明显增加( 恶化)。 另外, 七叶树提取液涂敷群与0 周时比较, 6 周后以及9 周后, 发现在外眼角的皱纹评分明显下降。通常, 七叶树提取液的抗肿胀活性为人们所知晓, 我们发现了这种提取液的皱纹改善作用。 我们认为, 通过成纤维细胞的收缩力使真皮细胞绷紧, 对皱纹具有这种有效性。 因此, 我们对七叶树提取液的成纤维细胞的收缩力促进作用进行了详细的探讨。在应力纤维的形成, 成纤维细胞所产生的力方面, 通过肌球蛋白轻链激酶( M L C K )、 罗一激酶( R h ok in a se )、 肌球蛋白磷酸酶( M L C P P a se )而几乎控制了肌球蛋白轻链的磷酸化/脱磷酸化。 肌球蛋白轻链通过氧化而使结构变化, 形成肌球蛋白丝, 并且促进形成肌动蛋白肌球蛋白丝, 经过A T P结合和磷酸离解而产生能量, 最终产生力。 进行这种磷酸化的酵素之一便是肌球蛋白轻链激酶( M L C K ), 这是C a 依赖性, 与钙调蛋白/C a 复合体有关。 通过另外一个磷酸化途径, 经查明, 罗.激酶( R h ok in a se )进行肌球蛋白轻链的磷酸化。 另外, 通过肌球蛋白磷酸酶( M L C P P a se )进行脱磷酸化, 将磷酸化肌球蛋白进行脱磷酸化, 解除丝的形成。 脱磷酸的阻断在M L C P P a se 上游罗一激酶( R h ok in a se )通过M L C P P a se 的亚单位的M B S ( 肌球蛋白结合Ⅱ 单位)的磷酸化, 进行M L C P P a se9 灭活化。 R h ok in a se在促进磷酸化的同时阻断脱磷酸化, 从而控制磷酸化状态。冈此, 对有关通过七叶树提取液而产生力的途径, 使用了各种阻断剂进行了研讨时, 经查明, 通过阻断R h o 激酶的H 7 而明显地受到阻断。 并且, 通过七叶树提取液而产生的力, 在肌球蛋白磷酸化酵素M L C K 的阻断剂M L 一9 方面, 经查明, 几乎未受到阻断。 另外, 作为产生力的刺激物质之一的凝血酶虽然产生力, 由于M L C K 的阻断剂因素, 几乎完全被阻断。另外, 在这些肌球蛋白轻链脱磷酸化的控制方面, 表明与蛋白激酶C ( P K C )、 酪氨酸激酶等有关, 使用P K C 阻断剂卡弗他丁C ( C a lp h o stinC )、 阻断剂K T 57 20 、 酪氨酸激酶阻断剂除莠霉素( H e r b im y cin )时, 七叶树提取液所产生的力完全不受阻断。从上述结果可以推断, 七叶树提取液并非产生对肌球蛋白轻链脱磷酸化酵素的M L C K 的作用力,而主要是通过对罗. 激酶( R h o k in a se )活性化, 促进肌球蛋白轻链的脱磷酸化酵素M L C P P a se 灭活化, 阻断脱磷酸化, 使肌动球蛋白系活性化, 促进力的产生。参考文献略。

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